提及2019年基因測序領(lǐng)域的發(fā)展，“單細胞測序”毫無疑問是其中關(guān)鍵詞。

2019年9月，美國單細胞測序公司10x Genomics在納斯達克上市，IPO3.9億美元，成為該領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊。國內(nèi)單細胞測序行業(yè)發(fā)展較為滯后，但也頗受資本青睞。2019年3月，萬乘基因完成五百萬元天使輪融資；6月，百奧智匯完成A輪融資，新格元生物完成近億元pre-A輪融資；10月，尋因生物完成數(shù)千萬元pre-A輪融資。

單細胞測序即從單個細胞水平上對基因組進行測序，把基因測序應(yīng)用到單個細胞層面，從而識別細胞的類型、功能，特定細胞健康或狀態(tài)的變化、變異。而常規(guī)的基于NGS的基因檢測，都是在大量細胞宏觀水平上，對整個細胞群進行遺傳分析。

近年來，單細胞測序相關(guān)研究與日俱增，截止到2019年，Pubmed中已發(fā)表1338篇科學(xué)文獻。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于科研行業(yè)神經(jīng)生物學(xué)、種系傳播、器官生長、癌癥生物學(xué)等多個領(lǐng)域的研究。

數(shù)據(jù)來源：Pubmed、動脈網(wǎng)整理

單細胞測序是單細胞遺傳物質(zhì)分析的重要手段，并不是單細胞研究的全部。放眼全球，單細胞研究已經(jīng)發(fā)展成多組學(xué)研究，包括單細胞轉(zhuǎn)錄組、基因組、表觀組、甲基化、ChlP、蛋白組等，總的來說主要聚焦在兩個領(lǐng)域：單細胞遺傳物質(zhì)分析與單細胞蛋白分析。

全球單細胞測序從2009年開始起步，彼時，北京大學(xué)湯富酬教授在博士后期間發(fā)表了世界第一篇單細胞mRNA測序的文章，引起業(yè)界廣泛關(guān)注。2012年，美國單細胞高通量測序公司10x Genomics、Mission Bio相繼成立。國內(nèi)單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用從2014年起步，但大都集中在低通量領(lǐng)域，應(yīng)用局限于應(yīng)用為胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（PGD），外周循環(huán)腫瘤細胞（CTC）等。

單細胞測序（SCS）發(fā)展歷程

（圖片來源：Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies、動脈網(wǎng)繪制）

在高通量測序領(lǐng)域，以試劑盒、微流控設(shè)備研發(fā)為核心的企業(yè)如尋因生物（2015年）、微著生物（2017年）、新格元生物（2018年）、萬乘基因（2018年）等通過自主研發(fā)核心技術(shù)微流控，將單細胞測序從實驗室走到市場，并完成早期融資；以單細胞生信分析為主的代表企業(yè)百奧智匯（2018年）也完成了IDG資本的A輪融資。

在基因?qū)用妫瑔渭毎麥y序可以獲取更精準的遺傳信息，在蛋白層面，通過分析單細胞表達的蛋白可以直接的獲取人體免疫相關(guān)的靶點，用于免疫診斷、新藥研發(fā)等。鑒于蛋白質(zhì)不具有直接擴增的特性，以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析靈敏度的限制，單細胞蛋白分析的常見、有效技術(shù)是質(zhì)譜分析，主要技術(shù)包括質(zhì)譜流式細胞術(shù)（Mass Cytometry）、TOF-SIMS（飛行時間二次離子質(zhì)譜儀）分析等。

質(zhì)譜流式技術(shù)平臺最初由美國DVS Science開發(fā)，但這家企業(yè)于2014年被美國Fluidigm以2.1億美元收購。國內(nèi)單細胞蛋白分析的代表企業(yè)為宸安生物、普羅亭，其中，宸安生物專注單細胞質(zhì)譜流式診斷設(shè)備、試劑和軟件開發(fā)，普羅亭致力于以單細胞蛋白層面研究為核心的檢測服務(wù)。

無論是基因?qū)用?，還是蛋白層面，單細胞分析技術(shù)已然成熟，但囿于成本并未廣泛應(yīng)用于市場上，更多的是為科研提供服務(wù)。動脈網(wǎng)整理了全球單細胞行業(yè)的目前發(fā)展狀況，以及單細胞技術(shù)在贏來大規(guī)模應(yīng)用之前面臨的挑戰(zhàn)與機遇。

單細胞測序主要有四個工作流程：單細胞制備、單細胞分離和文庫制備、測序和初級分析、生信分析。單細胞制備通常采用機械法、酶解法或其他組合方案將組織裂解，隨后將特定的細胞群富集、標記，成為單細胞樣本。單細胞分離與文庫制備是單細胞測序的關(guān)鍵步驟，與最終單細胞數(shù)據(jù)的質(zhì)量、精準度息息相關(guān)。低通量單細胞分離方法有梯度稀釋、口吸移液、自動顯微操作、激光捕獲顯微切割等，但由于一次只能處理一個細胞，日處理量為10個，效率低，成本高，應(yīng)用有限，本文不多作贅述。高通量單細胞分離的方法主要為三種，微孔（microwell-）、微液（microfluidic）以及微滴(droplet)，這三種方法都基于微流控原理。

基于微孔的捕獲技術(shù)可以使用細胞移液器或激光捕獲分離細胞，并將他們放置于微液流孔中。相較于另兩種方法，細胞通量低，且僅能用于轉(zhuǎn)錄組測序，不能應(yīng)用于其他組學(xué)。代表企業(yè)包括BD Biosicence、Cell Mircrosystem、Cellsee等。微液技術(shù)是在微米級結(jié)構(gòu)中操縱微小液體的科學(xué)技術(shù)，將單細胞的培養(yǎng)、制備、反應(yīng)、分離、檢測等步驟集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。相較于微孔，微液技術(shù)細胞通量更高，但缺點是，只有10% 的細胞能夠被捕獲到，代表企業(yè)包括Fluidigm。微流控芯片是微流控技術(shù)的核心壁壘，基于傳統(tǒng)單相的微流控芯片，逐步發(fā)展成為微液滴芯片，以微液滴芯片為核心的微流控技術(shù)成為微滴，微滴已得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，代表企業(yè)包括10x Genomics、萬乘基因、1Cellbio、Mission Bio、dolomite bio等。單細胞樣品經(jīng)捕獲分離獲得活性單細胞，隨后將活性單細胞遺傳信息擴增，建立測序文庫，最后使用Illumina測序系統(tǒng)對單細胞文庫進行測序，并進行遺傳物質(zhì)的生信分析。目前，國內(nèi)單細胞測序企業(yè)大部分集中在高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序設(shè)備、試劑、微流控芯片的開發(fā)，并積極探索高通量單細胞多組學(xué)測序相關(guān)技術(shù)。

（從上至下依次為Cell Mircosystem基于微孔的產(chǎn)品CellRaft、Fluidigm基于微液的捕獲技術(shù)C1、10x Genomics微滴系統(tǒng)Chromium）

單細胞蛋白分析采用的質(zhì)譜流式細胞術(shù)(Mass Cytometry)是一種將流式細胞技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合在一起的新技術(shù)。簡單來說，就是利用質(zhì)譜原理、獨特的金屬標記抗體標記細胞表面和內(nèi)部蛋白，對單細胞進行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)。它繼承了傳統(tǒng)流式細胞儀的高速分析的特點，又具有質(zhì)譜檢測的高分辨能力，能在單細胞水平同時分析超過50種細胞參數(shù)，相較于流式細胞技術(shù)常規(guī)分析4-10種蛋白，在分析效率上有極大的提升，是流式細胞術(shù)一個新的發(fā)展方向。質(zhì)譜流式采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記或識別細胞表面和內(nèi)部的信號分子，然后再用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）觀察單個細胞的原子質(zhì)量譜，最后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)，并通過專業(yè)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，從而實現(xiàn)對細胞生物標志物和信號網(wǎng)絡(luò)的觀察與分析。代表企業(yè)為Fluidigm和宸安生物。

單細胞測序與蛋白研究中雖然使用不同的核心技術(shù)，但本質(zhì)都是從單細胞水平去探索、發(fā)掘基因、蛋白在機體的作用機制，兩者各有所側(cè)重，各有優(yōu)勢。單細胞測序核心技術(shù)的微流控檢測對象為核酸，借助于其高通量地檢測能力，在單細胞轉(zhuǎn)錄組、基因組、表觀組等多組學(xué)研究中起著非常關(guān)鍵的作用。

現(xiàn)有技術(shù)的條件可以實現(xiàn)同時對1萬個細胞進行分析，雖然市面上有許多的基因數(shù)據(jù)分析軟件，但整個建庫、測序和數(shù)據(jù)分析仍然耗時長，單次測序時間至少為兩周，測序成本高。單細胞蛋白分析的核心技術(shù)是質(zhì)譜流式細胞術(shù)，檢測對象為胞內(nèi)或者細胞表面蛋白，因此在包括血液系統(tǒng)疾病、腫瘤免疫治療和免疫系統(tǒng)疾病在內(nèi)的復(fù)雜疾病的診斷領(lǐng)域更具優(yōu)勢，質(zhì)譜流式細胞術(shù)可實現(xiàn)對多達100萬的細胞進行50種不同生物標志物分析檢測，由于質(zhì)譜分析壁壘高，針對單細胞的質(zhì)譜分析軟件較少，通常需要企業(yè)自行研發(fā)，但總體單細胞蛋白分析耗時較短，為1-2小時。  

單細胞領(lǐng)域企業(yè)一覽表

總的來看，國內(nèi)單細胞技術(shù)領(lǐng)域主要集中在單細胞測序技術(shù)平臺的研發(fā)，構(gòu)建核心技術(shù)壁壘上，專注提供單細胞生信分析服務(wù)的企業(yè)較少，單細胞蛋白領(lǐng)域較少企業(yè)涉足，仍具備一定的市場空間。

單細胞測序技術(shù)已經(jīng)在科研領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，最為直接的是用于腫瘤免疫的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究、伴隨診斷和用藥指導(dǎo)。包括腫瘤免疫治療的評估、伴隨診斷、療效評估，腫瘤個性化用藥指導(dǎo)，腫瘤及疾病標志物、細胞類群變化鑒定等。例如，腫瘤新抗原療法是單細胞測序技術(shù)與臨床應(yīng)用進行早期結(jié)合的一個應(yīng)用方向。腫瘤新抗原是一種個體化的治療方案，每個人的腫瘤細胞都有特異性的抗原，研究人員由此預(yù)測新抗原，并進行針對性治療。新抗原的存在性和抗原性檢測是基于DNA而非基因表達做出的，這就需要結(jié)合單細胞測序來確定新抗原的表達強度，從而實現(xiàn)快速篩選。

又如，在液體活檢領(lǐng)域，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的施奇惠教授研究發(fā)現(xiàn)，CTC（循環(huán)腫瘤細胞）檢測可以用于腫瘤早篩以及腫瘤轉(zhuǎn)移檢測，但CTC細胞具有異質(zhì)性，不同技術(shù)路線將捕捉到不同純度、亞型的CTC，就難以通過檢出的CTC來判斷腫瘤是否轉(zhuǎn)移。通過單細胞測序技術(shù)可以檢測并分辨出極為微量的CTC，有望發(fā)掘CTC的臨床價值。

單細胞測序在還可以應(yīng)用于微生物研究，神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域，具體包括：

1、 用于新物種鑒定、病原進化、耐藥檢測、臨床診斷等微生物分析

2、 用于探索神經(jīng)元細胞亞型及其與阿爾茲海默癥、帕金森、精神分裂癥、抑郁癥等疾病的發(fā)作機制等神經(jīng)科學(xué)分析。

3、 精確檢測單個免疫細胞的遺傳物質(zhì)，分析單個免疫細胞而非組織群體免疫細胞在免疫機制中的作用等的免疫學(xué)領(lǐng)域研究。

單細胞蛋白組學(xué)在腫瘤免疫治療也具有的應(yīng)用潛力，主要應(yīng)用包括：

1、 通過檢測血液蛋白，尋找癌癥早期診斷以及指導(dǎo)分子靶向治療的生物標志物組合。

2、 探索免疫療法的細胞通路，作用機制，預(yù)測治療反應(yīng)。

當然，單細胞蛋白組學(xué)的應(yīng)用并不局限在腫瘤免疫領(lǐng)域，在免疫學(xué)、干細胞、疫苗研究等多個領(lǐng)域都已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)以及轉(zhuǎn)化研究。以下我們將列舉單細胞領(lǐng)域企業(yè)，了解單細胞多組學(xué)在科研、臨床的應(yīng)用以及產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀。

10x Genomics成立于2012年，公司面向全球提供單細胞測序設(shè)備，目前已經(jīng)推出單細胞測序平臺GemCode、Chromium。其中，Chromium平臺增加了單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫的功能，一次建庫測序最多可獲得6000個細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。10X正在與Agilent合作，共同研發(fā)外顯子組單細胞測序產(chǎn)品。

2018年，10x 先后收購了表觀遺傳學(xué)公司Epinomics和空間基因組技術(shù)公司Spatial Transcriptomics，以此完善其在RNA測序中的能力。2019年9月，10x Genomics在納斯達克上市，IPO3.9億美元。

萬乘基因成立于2018年，專注于自主研發(fā)高通量單細胞測序平臺，包括微流控設(shè)備、微液滴芯片、多組學(xué)試劑、分析軟件等，可以單次并行分析一萬個細胞。萬乘基因已經(jīng)完成500萬元天使輪融資，除轉(zhuǎn)錄組、ATAC外，公司最新研發(fā)的產(chǎn)品涵蓋了單細胞甲基化、ChlP等表觀組學(xué)領(lǐng)域。與美國上市單細胞測序公司10x Genomics相比，萬乘基因不僅是單細胞測序上游的儀器設(shè)備和試劑提供商，還面向終端用戶提供系統(tǒng)的單細胞研究解決方案，包括從研究設(shè)計，樣品制備到生信分析的全套服務(wù)。

目前，萬乘基因正在與多家免疫相關(guān)公司探索單細胞測序技術(shù)在抗體開發(fā)、TCR篩選、新抗原檢測中的應(yīng)用。

宸安生物成立于2015年，專注于自主研發(fā)質(zhì)譜流式細胞技術(shù)平臺，實現(xiàn)高通量單細胞蛋白分析。平臺包括核心試劑，用于標記細胞蛋白的獨特的金屬標記抗體，設(shè)備儀器，以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件。公司已完成數(shù)千萬元A+輪融資，不同于國外對標企業(yè)Fluidigm的質(zhì)譜流式平臺（初由DVS Sciences研發(fā)，后被Fluidigm收購），宸安生物開發(fā)的質(zhì)譜流式技術(shù)平臺聚焦臨床應(yīng)用。宸安生物的高效質(zhì)譜流式細胞技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)單細胞的50種蛋白質(zhì)表達水平分析，并聚焦于血液系統(tǒng)疾病的診斷和腫瘤免疫療法的診斷產(chǎn)品開發(fā)。

盡管微流控技術(shù)、測序技術(shù)、質(zhì)譜流式細胞術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了在單細胞水平的遺傳物質(zhì)、蛋白分析與檢測，并廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域，但要將其產(chǎn)業(yè)化，仍面臨不少挑戰(zhàn)。百度風(fēng)投認為，單細胞檢測與分析產(chǎn)業(yè)化難點有三處：

1、工程迭代周期長，技術(shù)實現(xiàn)到工程穩(wěn)定再到下游應(yīng)用分析全鏈條實現(xiàn)，單細胞多組學(xué)分析的質(zhì)量受單細胞捕獲效率、試劑體系、設(shè)備通量和精度等條件制約，涉及微流控技術(shù)、極微量分析定量、海量生物數(shù)據(jù)分析等核心技術(shù)，對團隊綜合能力要求極高；

2、單細胞檢測成本高，單細胞多組學(xué)分析是一個綜合系統(tǒng)的工程，從單細胞樣品制備、分離捕獲，到上機基因測序或蛋白檢測，原來一份Bulk樣本的檢測量變成了一萬份單細胞樣本，當前的使用成本仍不適合大規(guī)模臨床采用； 

3、數(shù)據(jù)分析與臨床需求結(jié)合難度高，單細胞分析將獲得更為復(fù)雜的基因、蛋白數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)與臨床表型有怎樣的關(guān)聯(lián)，如何進行分析，這些都是單細胞生信分析的難點。因此，要將單細胞多組學(xué)研究大規(guī)模應(yīng)用，需要從整體水平，各個環(huán)節(jié)降低成本，克服技術(shù)壁壘，并找準單細胞數(shù)據(jù)與臨床的契合點。

合力投資指出，單細胞測序的核心在于測序前處理，其中難點在于如何形成規(guī)模效應(yīng)，及時處理樣本，富集測試對象細胞，然后在單細胞水平精準標注、區(qū)分不同的細胞，形成單細胞水平、分子水平的標簽，這對樣本處理來說是極大的挑戰(zhàn)。

此外，單細胞水平數(shù)據(jù)分析與細胞團層面的數(shù)據(jù)分析相比，數(shù)據(jù)維度更高，每個單細胞數(shù)據(jù)都將可能成為數(shù)據(jù)分析的新的維度，這也讓單細胞測序數(shù)據(jù)分析難以有所突破。

在產(chǎn)業(yè)化方面，單細胞測序有兩個極具前景的產(chǎn)業(yè)化機遇，一是單細胞測序儀器的設(shè)計和開發(fā)，這一點，10x Genomics就是典型；另一個是臨床的應(yīng)用，即通過不斷的升級迭代，降低單細胞測序費用的成本，讓單細胞測序價格達到臨床可接受或可支付的水平，最終在臨床得到大規(guī)模應(yīng)用。

從2009年到2019年，經(jīng)過十余年的發(fā)展，隨著基因測序成本降低，微流控、質(zhì)譜流式細胞術(shù)等核心技術(shù)取得突破，基于單細胞水平的遺傳物質(zhì)、蛋白分析已廣泛應(yīng)用于免疫、微生物研究，神經(jīng)科學(xué)等科研領(lǐng)域。但單細胞分析囿于成本高、門檻高、分析難并未達到大規(guī)模應(yīng)用的程度，目前更多用于攻克腫瘤、免疫等疾病領(lǐng)域的難題。單細胞領(lǐng)域企業(yè)適才起步，在多組學(xué)分析中大多集中在轉(zhuǎn)錄組、蛋白組領(lǐng)域。

可以預(yù)測的是，隨著10x Genomics的上市，單細胞多組學(xué)研究的深入，基因測序成本進一步降低，基于單細胞水平的測序、蛋白分析極具發(fā)展?jié)摿?，為人們認識疾病、理解免疫機制、藥物發(fā)現(xiàn)等提供新的視角與方案。

來源：動脈網(wǎng)